2013年5月份江苏省吴江市八坼镇附近网箱养殖的加州鲈接连发生发病死亡现象，发病对象主要为2龄加州鲈，病害主要以细菌性出血病为主，给养殖户造成了不小的经济损失。加州鲈[Micropterus salmoide (Lacépède)]又名大口黑鲈（Largemouth black bass），隶属于鲈形目（Perciformes）、鲈亚目（Porcoidei）、太阳鱼科（Centrarchidae）、黑鲈属（Micropterus）。加州鲈是广温肉食性淡水名贵鱼类，具有个体大、生长快、适应性强、肉味鲜美等优点。该鱼喜栖息于沙质或沙泥质且混浊度低的缓流静水中，是发展池塘养殖的重要经济鱼类之一；同时该鱼较贪食，易上钩，又是发展休闲渔业的好品种。

   本实验对此次加州鲈病害的细菌性病原体为研究对象，通过分离纯化，形态学观察，结合16S rRNA基因序列同源性检索，对该病原菌进行初步判断；通过药敏实验，了解该病原菌对各种抗生素的耐药性和敏感程度，在此理论基础上，结合实际养殖情况和发病情况，对该病建立了有效的防治技术，治疗效果良好。


1  材料与方法

1.1  材料

   苏州市天德水产科技有限公司提供的某养殖户的患病鲈鱼（濒死）若干条、BHI培养基（BD）、细菌基因组DNA提取试剂盒和药敏纸片（杭州微生物试剂有限公司）。

1.2  方法

1.2.1  病例检验

   2013年5月，对江苏省吴江市八坼镇附近加州鲈网箱养殖的发病情况、病理变化等进行检查。

1.2.2   细菌分离与纯化

   采用平板划线法，在BHI固体培养基上对濒死的患病加州鲈的肝、脾和肾等实质性器官进行接种培养。接种后将培养皿置于28℃生化培养箱中过夜培养。选择呈优势生长的单菌落，在BHI固体培养基上进行纯化培养，从而得到单一菌种，并对得到的纯菌株进行革兰染色镜检。

1.2.3  16S rRNA基因序列的PCR扩增测序及同源性检索

   对分离得到的纯菌株进行细菌基因组DNA进行提取后，采用16S rRNA基因通用引物进行扩增。

   所用引物：27F：5ˊ-AGAGTTTGATC(C/A)TGGCTCAG-3 ˊ

1492R：5ˊ-GGTTACCTTGTTACGACTT-3 ˊ(Martin et al, 1998)

20μl反应体系，PCR反应条件为：94℃预变性2min， 94℃变性1min，45℃复性1.5min，72℃延伸1.5min，30个循环后，72℃温育2min。

   PCR扩增后样品送往上海生工生物工程有限公司测序。

1.2.4  药敏实验

   采用纸片扩散法，病原菌接种BIH 液体培养基，28℃震荡培养24h，参照麦氏比浊管调整菌液浓度为1.0×108CFU/ml ，将菌液均匀涂布在BIH平板上，贴上药敏纸片，28℃培养24h，测量抑菌圈大小并判定结果。

1.2.5  治疗方法

   根据病原菌鉴定和药敏试验结果，以外用和内服相结合的方法进行治疗，外用药选用二氧化氯，内服药选用湖南威克尔的福康（氟苯尼考粉）和武汉华扬的盐酸多西环素粉。具体的治疗方法是按说明书的用量在网箱中使用二氧化氯，福康和盐酸多西环素粉以每次每1kg鱼体重分别用药0.1~0.15g和0.02g的剂量进行拌料投喂，每日1次，连续用药7d。


2  实验结果

2.1  自然发病病例临床特征

   发病加州鲈主要为2龄加州鲈，大小为25cm左右，鳃充血，肛门红肿突出，尾鳍和腹鳍充血，背鳍基部有溃烂，解剖后，肝脾肿大，肝充血，脾黑红，气囊内壁充血，肌肉出血。

2.2  细菌分离

   通过平板划线法进行分离和纯化，在患病加州鲈肝、脾和肾处都得到大小、形态一致的菌落，最终分离出单一的纯菌株。该菌在BHI固体培养基平板上培养24h后，形成3~4mm，圆形光滑、边缘整齐、乳白色、中间凸起的菌落。革兰染色呈红色，为阴性杆状菌。

2.3  16S rRNA基因序列同源性检索

   PCR扩增出该菌株的16S rRNA基因片段大小约为1500bp，测序结果表明其片段长度为1447bp。将该序列在GenBank数据库中与已报道的细菌基因序列进行Blast分析，结果发现该菌株与嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）的同源性达99%，结合形态学初步判断该菌为嗜水气单胞菌。

 2.4  药敏实验

   药敏实验结果见表1，由实验结果可知，该菌对喹诺酮类（左氧氟沙星、诺氟沙星）、氯霉素类（氟苯尼考）、呋喃类（呋喃妥因）、四环素类（强力霉素）、头孢菌素类（头孢哌酮）和大环内酯类（新生霉素）等药物敏感，对磺胺类（磺胺异恶唑）、氨基糖苷类（链霉素）等药物不敏感或耐药。

2.5   治疗效果

   根据病原菌的鉴定结果，选用二氧化氯为外用药，福康和盐酸多西环素为内服药，以网箱内泼洒二氧化氯溶液和投喂福康、盐酸多西环素相结合的方法进行治疗。用药后第4天，死鱼数量逐渐减少，鱼的摄食量也逐步增加，病情得到初步控制，用药一周后死鱼现象消失，治疗效果好。（作者：宣云峰1   沈勇亮2  顾泽茂2；1苏州市天德水产科技有限公司；2华中农业大学水产学院）