生产黑木耳二级种用的培养基有木屑米糠（麸皮）培养基，其配方为木屑78％，米糠（麸皮）20%，石膏1%，糖1%，棉粒壳培养基，其配方有二，一种是棉籽壳（无棉仁）90%，麸皮（米糠）8%，糖1%，石膏1%，含水量60%～65%；另一种是棉籽壳（无棉仁）39%，木屑39%，米糠20%，糖1%，石膏1%，含水量60%～65%。

如配方中有棉籽壳成分的，棉籽壳需要预湿，然后拌入，翻拌要求均匀，然后装瓶、灭菌、冷却、接种、培养。黑木耳二级种的培养温度为25～28℃，避光培养。