肉的嫩度是肉品质的一个重要指标。导致肉质嫩度不同的主要因素有肌节的长度、结缔组织的含量及肌肉结构蛋白的水解敏感性（Llia等，2001）。目前主要集中在宰后肌肉嫩度与肌肉蛋白质的降解量相关研究上。研究发现，在肌肉组织中钙蛋白酶系统控制着肌纤维蛋白的降解，是肌肉蛋白质降解的限速步骤（Hokins，2001），因此钙蛋白酶系统在肉的嫩化中起着重要作用。

1  钙蛋白酶系统的结构及功能

1.1  钙蛋白酶结构根据钙蛋白酶（Calpain）表现半最高活性所需的Ca2+浓度的不同，可以将普遍存在的Calpain分为两种，一种为μ－Calpain（又称Calpain Ⅰ）激活所需Ca2+浓度为微摩尔级，另一种为m－Calpain（又称 Calpain Ⅱ）激活所需 Ca2+浓度为毫摩尔级。它们都由2个亚基组成，其中30 kDa小亚基在2种Calpain中是相同的，是单个基因的产物，而80 kDa大亚基则是木同基因的产物。两种Calpain都具有水解肌原纤维蛋白的活性。

    比较不同来源的 Calpainc DNA发现，它们具有高度的同源性，尽管μ一Calpain和m－Calpain大亚基氨基酸序列有明显差异，但其结构是基本相同的，都由4个结构域组成，结构域Ⅰ和结构域的功能还不太清楚，有可能与蛋白酶调控亚基或其他调控蛋白如抑制蛋白、激活蛋白的相互作用有关。而且位于氨基端的结构域Ⅰ，在蛋白酶激活的情况下，很容易发生自溶，由此推测其可能起钙蛋白酶的活性调节作用；结构域Ⅱ是表现水解活性的关键部位，与半胱氨酸蛋白酶如木瓜蛋白酶、组织蛋白酶有相似性；结构域Ⅳ是钙结合的部位，与其他钙结合蛋白如钙调素蛋白（CaM）、肌钙蛋白（Troponin C）都有明显的相似性，都含有钙结合蛋白所特有的4个EF-手结构。

    小亚基含有两个结构域，两结构域之间由一段富含脯氨酸的序列连接，结构域和大亚基结构域类似，也有4个EF-手结构，故也具有结合钙的活性。除了上述两种普遍存在的Calpain外，还发现了组织特异性表达的Calpain，称为p 94或nCL－l，其结构与前两种相似，只是比它们多了3个插入序列，与结构域的同源性比较差。

1．2   钙蛋白酶抑制蛋白的结构   钙蛋白酶抑制蛋白（Calpastatin）是胞内专一抑制Calpain活性的蛋白质，可以识别Calpain与钙结合引起的构象变化并与之特异性结合。Calpastatin共有5个结构域，其中4个是Calpastatin的活性中心所在，具有相似的重复单位，重复区域具有相当保守的30个氨基酸序列，都包含有Thr－Ile－Pro－Pro-X－Tyr－Arg，因此它可能是Calpastatin起作用的关键部位。X代表不同的氨基酸，对CalPastatin的活性具有重要的作用。

1．3 钙蛋白酶系统结构与活性关系  当Calpain的大小亚基相结合时，不具有活性。Yoshizawa等（1995）发现，Calpain）经 Ca2+激活后，其大小亚基分离，因此认为小亚基有可能主要起调节的作用，大亚基起催化调节作用。分离后30 kDa小亚基迅速降解为17 kDa，而这一变化是Calpain发挥水解特性的前提（Dorothy等，1992）。80 kDa的 Cal－pain一般不具有活性，当其先转化成78 kDa再变成76 kDa的自溶形式时方具有活性，且迅速降解而失去酶活性（Geert，1999）。由于Calpain在自溶后才表现活性，因此可将Calpain看成是一个酶原，而Calpain活性下降则是其发挥水解作用的标志。

    Calpaslatin的分子量大小的报道不一致，但其在宰后肌肉中也会发生降解，且降解后的Calpas－tatin同样具有抑制Calpain的活性。E.F.Deigado等（2001）研究表明，刚宰后的肌肉中Calpastatin多以125 kDa的形式存在，而3 d后以分子量约为65kDa的多肽形式存在，还具有明显抑制Calpain的活性，但抑制能力有所下降。

2  钙蛋白酶系统对肌原纤维的作用

    从目前研究看，Calpain的作用可能是调节细胞内蛋白质的降解，而非整个降解过程的直接参与者。体外试验表明，Calpain降解肌原纤维骨架蛋白，如结合蛋白（Desmin）丝蛋白（Filamen）C－蛋白、原肌球蛋白（Tropomyosin）、肌原蛋白T（Tro－ponin一T)、连接蛋白（Titin）、Nebulin、Vinculin等，但不降解α-肌动蛋白（α－Actin）、肌球蛋白（Myosin）及α-辅肌动蛋白（α－Actinin)。因此推测，Calpain可能通过对肌原纤维蛋白进行特异的局部降解而对其结构和功能进行调控（JingHuang，1998）。据推测Calpain导致肌肉降解可分为两步：首先攻击肌原纤维的肌节（两个相邻Z盘之间的一段肌原纤维）部位，释放肌丝使降解为小片段，然后被溶酶体所捕获而进一步降解。

    Calpain主要集中于Z盘，因此认为降解从此处开始。但近期研究发现，Calpain首先水解的是N 2线，据报道N 2线是Titin和Nebulin丝蛋白所在区域，它们分别连接粗肌丝和细肌丝，最终通过I带伸向Z盘。在降解N2线的同时，也会降解一些骨架蛋白如 Desmin，使肌纤维释放肌丝。细肌丝的肌原蛋白和原肌球蛋白及粗肌丝的C-蛋白降解，分别解离出肌球蛋白和肌动蛋白。释放出的粗肌丝和细肌丝可与母体或其他肌原纤维重新装配，也可被胞质蛋白酶或溶酶体降解。Calpain参与骨架蛋白的降解，是蛋白质水解过程中的限速步骤。

3 钙蛋白酶的活性调节

    Calpain的活性调节在体内和体外有所区别，在体内的活性调节了解不多，活性调节研究主要集中于体外试验中。

3.1 钙蛋白酶的激活调节  Calyain是钙依赖蛋白，只有在Ca2+存在的情况下方有活性，在体现水解活性时大致发生以下4个过程的变化：l）Calpain大小亚基的分离；2）小亚基的自溶; 3）大亚基自溶;4）Calpain构象发生变化而表现蛋白水解酶活性。Calpain受激活后最终呈自溶状态而表现活性，因此通常把Calpain是否发生自溶看做是Calpain是否已被激活的标志。Calpain受Ca2+浓度调控，高Ca2+浓度能加速Calpain的活化。

    除了Ca2+浓度，Calpain的活性还受离子强度、pH、底物等因素的影响。m－Calpain和μ－Calpain的水解活性随着离子强度增加而降低，但趋势并不明显，这可能是因为酶的聚合或 Ca2+ - Calpain复合物稳定性降低；随着pH值的增加，μ-Calpain水解活性增加；底物存在时，Calpain的活性下降慢，且不同底物Calpain表现的活性也不同（Mohammad Koohmarate，1992）。其机理还不清楚，可能与Calpain自溶状态的稳定性有关（Geerr等，1999）。

3.2  Calpain的抑制调节   Calpain抑制剂有内源性和外源性两种，其中外源性抑制剂又可分为过渡类似物和不可逆抑制剂等。

3.2.l 不可逆抑制剂及作用原理  这些抑制剂可以以共价键的方式与酶的某些基团牢固结合，而使酶失去活性。Calpain是1种含巯基的酶，因此碘乙酸、碘乙酰胺、E－64等对Calpain可发生不可逆抑制作用。

3．2．2   过渡类似物抑制剂及原理μ－Calnain和m－Calpain作用于底物的特异性切割位点大部分是一致的，大量试验表明Calpain切割位点P1最佳为精氨酸、组氨酸、酪氨酸或甲硫氨酸残基，P2最佳为亮氨酸或缬氨酸残基，且P2被认为是决定位点。但切割位点是由多个因素决定的，如切割位点两端的氨基酸残基、离切割位点附近的氨基酸残基和底物的其他结构特征等。李昭昭（1995）改变二肽P1位氨基酸残基、末端氨基保护基、酯基，发现这些改变都会引起抑制能力变化，证实了前者的说法。根据这些特性，研究者人为地合成一些多肽以抑制 Calpain的活性，如 Leupeptin（丙酸基／乙酸基一L－Leu－L－leu－L一arg)、三肽氯甲基酮（Leu－Leu－Phe／Lys／Tyr－CMK）、二肽、三肽α一酮酸酯（Ph2CHCO－Leu－Abu－COOEt，2－NapCO－Leu－Leu－Abu－COOEt)。这些多肽对Calpain的抑制能力都大于典型的氯甲基酮抑制剂如Tosyl－Phe－CH2Cl。这可能是因为它们在P2位点都含有亮氨酸，这说明P2位氨基酸残基是Calpain重要的识别位点。

3.2.3  Calpastatin的调节Calpastatin是高效的，十分专一的Calpain活性抑制蛋白。当Calpain被Ca2+激活后，如果附近有Calpastatin存在，将迅速与之结合而抑制Calpain活性，从而保证Calpain对底物只进行局部的特定位点的水解。这可能是源于Calpastatin对μ-Calpain的自溶稳定性的影响。80 kDa亚基的μ－Calpain首先转化为78－kDa，然后转化为76－kDa的自溶产物，再进一步自溶而失活。Calpastatin能抑制μ－Calpain一系列的变化，且呈剂量依赖性关系。而自溶作用是钙蛋白酶表现活性的重要步骤，由此可见Calpas－tatin是通过抑制Calpain的自溶作用而发挥作用的，且这种抑制作用并不受pH的影响（Roman等，1999）。

4 钙蛋白酶系统与嫩度的关系

    宰后肉的嫩化现象是非常普遍的，Calpain表达减少以及Calpastatin表达量的增加都会导致肌肉蛋白水解率及宰后肉嫩度的下降，这表明Cal－pain水解作用是导致肉嫩化的主要因素。μ－Calpain和m－Calpain都能水解肌原纤维，但在宰后成熟的过程中m－Calpain的活性几乎不变，而μ－Calpain的活性则显著下降。钙蛋白酶活性下降，则是其发挥水解作用的体现，因此人们普遍接受μ－Calpain而不是m－Calpain参与了肉的嫩化，这可能是因为活体细胞内的Ca2+浓度太低（100μmol）不足以激活m－Calpain（Whipple和Koohmaraie，1991)。同时 Calpastatin也参与了肌肉嫩化过程，其活性也随时间的增加而降低。

    钙蛋白酶系统调节肌肉嫩化具体机制还不是很清楚。Delgado等（2001）研究发现，肉的嫩化与Calpastatin活性及降解速度有关，而与μ－Calpain、m－Calpain的活性及降解速度没有明显的关系。Pringle等（1997）用Angus（A）和Brahman（B）及其杂交牛为对象做试验研究，表明μ－Calpain的活性与嫩度具有相关性，而Calpastatin活性与嫩度的相关性并不很明显。试验还表明，在钙蛋白酶系统中与嫩度最高度相关的是Calpastatin与μ－Calpain活性的比值。Ilian等（2001）研究发现，除了μ－Calpain与肉嫩度有关外，肌肉组织特异表达p94对嫩度影响也很大，其mRNA水平与肌肉的相对嫩度具有高度相关性[（bovine）＝0．522，r（ovine）＝0．706]。而 Parr等（1999）研究表明，p 94与猪背最长肌的嫩度并没有直接的关系。

    综上所述，钙蛋白酶系统的确在肉的嫩化过程中起着至关重要的作用，但究竟是哪个酶在这过程中起决定性作用报道并不一致。这可能是因为：1）钙蛋白酶系统是一个复杂的、高度调控的蛋白降解体系；2）所用的试验方法的不一致；3）各酶的不稳定性，在提取过程中活性的降低。

　　5 与Calpain活性有关的几种物质对肉嫩度的影响

　　5.1  CaCl2对肉嫩度的影响  Calpain受Ca2+浓度的激活，而活体细胞内的Ca2+浓度一般不能激活m－Calpain。CaCl2能使肉变嫩的原因，可能是其能够同时快速激活肌肉中μ－Calpain和m－Calpain的活性，且克服了Calpastatin抑制作用，研究发现钙能降低Calpain系统中各酶的活性。μ－Calpain和m－Calpain的活性降低说明其对肌原纤维的水解增加，Calpastatin活性降低则说明其抑制Calpain的能力下降。Whipple等(1993）指出，这有可能是因为在钙浓度足够高的情况下能激活m－Calpain，能增加Calpastatin的水解从而使Cal－pastatin的调节能力降低。Pringle等（1999）在肌肉中注射CaCl2以研究其改善肉嫩度的情况，结果表明CaCl2能同时降低Calpain系统中3种酶的活性，μ－Calpain、m－Calpain和Calpastatin的活性分别降低了75％、77％和 34％，而相应的肉的剪切力都明显的下降，因此认为钙能激活钙蛋白酶系统从而改善肉质。但肉嫩度提高的程度，与肌肉的类型与品种有很大的关系。A型牛比B型牛嫩度要提的高些，不同部位肉的嫩化程度也相差很大。

　　5．2  维生素D3（VD3）对肉嫩度的影响  Swanek等（1999）研究发现，VD3能够明显改善宰后牛背最长肌的嫩度，屠宰前7d饲料中添加5×106IUVD3的牛与对照组相比，其背最长肌的剪切力下降了0．58 kg。这有可能是因为 VD3能够动员骨骼中的钙，刺激小肠中钙的吸收以及促进肾小管重吸收钙，从而使血清中Ca2+的浓度增加所致。且VD3还能通过激活Ca2+的通道，增加Ca2+在骨骼肌中的流量，最终使骨骼肌中钙的浓度升高约0．53 mmol。此时Ca2+的浓度足可以激活钙蛋白酶系中的Calpain，导致肉嫩度的提高。

　　5．3  焦磷酸钠（NaPPi）对肉嫩度的影响  NaPPi含有多个阴离子，具有很强的缓冲能力（pH 6．5～9．0），能缓和肉中pH值降低的趋势，提高肉成熟过程中的pH值。Lee等，（2000)发现，在宰后的肉中注射NaPPi，能显著改善肉的嫩度，与其提高肉的州值密切相关。NaPPi还能提高离子强度和降低肉的温度，这些都能增进Calpain的激活，提高水解蛋白的能力从而提高肉的嫩度。

　　6 结论与展望

  钙蛋白酶引起肌肉中蛋白质的水解，是导致宰后肌肉嫩化的主要原因，这已成定论。因此，可以通过激活Calpain或降低Calpastatin活性的方式提高肉的嫩度，改善肉质。但总的来说，钙蛋白酶系统的具体调控及生理功能还不很清楚，哪种酶在嫩化过程中起主要作用还需通过分子生物学技术等相关手段加以研究。