本标准参照采用ISO 5983-1979《动物饲料-氮含量的测定和粗蛋白含量计算》。

　　1 主题内容与适用范围

　　本标准规定了饲料中粗蛋白含量的测定方法。

　　本标准适用于配合饲料、浓缩饲料和单一饲料。

　　2 引用范围

　　GB 601 化学试剂 滴定分析（容量分析）用标准溶液的制备

　　3 原理

　　凯氏法测定试样中的含氮量，即在催化剂作用下，用硫酸破坏有机物，使含氮物转化成硫酸铵。假如强碱进行蒸馏使氨逸出，用硼酸吸收，再用酸滴定，测出氮含量，将结果乘以换算系数6.25，计算出粗蛋白含量。

　　4 试剂

　　4.1 硫酸（GB 625）：化学纯，含量为98%，无氮。

　　4.2 混合催化剂：0.4g 硫酸铜，5个结晶水（GB 665），6g硫酸钾（HG 3-920）或硫酸钠（HG 3-908），均为化学纯，磨碎混匀。

　　4.3 氢氧化钠（GB 629）：化学纯，40%水溶液（M/V）。

　　4.4 硼酸（GB 628）：化学纯，2%水溶液（M/V）。

　　4.5 混合指示剂：甲基红（HG 3-958）0.1%乙醇溶液，溴甲酚绿（HG 3-1220）0.5乙醇溶液，两溶液等体积混合，在阴凉处保存期为三个月。

　　4.6 盐酸标准溶液：邻二甲苯氢钾法标定，按GB 601制备。

　　4.6.1 0.1mol/L盐酸（HCl）标准溶液：8.3mL盐酸（GB 622），分析纯，注入1000mL蒸馏水中。

　　4.6.2 0.02mol/L盐酸（HCl）标准溶液：1.67mL盐酸（GB 622），分析纯，注入1000mL蒸馏水中。

　　4.7 蔗糖（HG 3-1001）：分析纯。

　　4.8硫酸铵（GB1396）：分析纯，干燥。

　　4.9 硼酸吸收液：1%硼酸水溶液1000mL，加入0.1%溴甲酚绿乙醇溶液10mL，0.1%甲基红乙醇溶液7mL，4%氢氧化钠水溶液0.5mL，混合，置于阴凉处保存期为一个月（全自动程序用）。

　　5 仪器设备

　　5.1 实验室用样品粉碎机或研钵。

　　5.2 分样筛：孔径0.45mm（40目）。

　　5.3 分析天平：感量0.0001g。

　　5.4 消煮炉或电炉。

　　5.5 滴定管：酸式，10、25mL。

　　5.6 凯氏烧瓶：250mL。

　　5.7 凯氏定氮装置：常量直接蒸馏式或半微量水蒸馏式。

　　5.8 锥形瓶：150、250mL。

　　5.9 容量瓶：100mL。

　　5.10 消煮管：250mL。

　　5.11 定氮仪：以凯氏原理制造的各类型半自动、全自动蛋白质测定仪。

　　6 试样的选取和制备。

　　选取具有代表性的样品用四分法缩减至200g，粉碎后全部通过40目筛，装于密封容器中，防止试样成分的变化。

　　7 分析步骤

　　7.1 仲裁法

　　7.1.1 试样的消煮

　　称取试样0.5~1g（含氮量5~80mg）准确至0.0002g，放入凯氏烧瓶（5.6）中，加入6.4g混合催化剂（5.4），与试样混合均匀，再加入12mL硫酸（4.1）和两粒玻璃珠，将凯氏烧瓶（5.6）置于电炉（5.4）上加热，开始小火，待样品焦化，泡沫消失后，再加强火力（360~410℃）直至呈透明的蓝绿色，然后再继续加热，至少2h。

　　7.1.2 氨的蒸馏（蒸馏步骤的检验见附录)

　　7.1.2.1 常量蒸馏法

　　将试样消煮液（7.1.1）冷却，加入60~100mL蒸馏水，摇匀，冷却。将蒸馏装置（5.7）的冷凝管末端浸入装有25mL硼酸（4.4）吸收液和2滴混合指示剂（4.5）的锥形瓶内。然后小心地向凯氏烧瓶（5.6）中加入50mL氢氧化钠溶液（4.3），轻轻摇动凯氏烧瓶（5.6）使溶液混匀后再加热蒸馏，直至流出液体体积为100mL。降下锥形瓶，使冷凝管末端离开液面，继续蒸馏1~2min，并用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液均需流入锥形瓶内，然后停止蒸馏。

　　7.1.2.2 半微量蒸馏法

　　将试样消煮液（7.1.1）冷却，加入20mL蒸馏水，转入100mL容量瓶中，冷却后用水稀释至刻度，摇匀，作为试样分解液。将半微量蒸馏装置（5.7）的冷凝管末端浸入装有20mL硼酸（4.4）吸收液和2滴混合指示剂（4.5）的锥形瓶（5.8）内。蒸汽发生器（5.7）的水中应加入甲基红指示剂数滴，硫酸数滴，在蒸馏过程中保持此溶液为橙红色，否则需补加硫酸。准确移取试样分解液10~20mL注入蒸馏装置的（5.7）反应室中，用少量蒸馏水冲洗进样入口，塞好入口玻璃塞，再加10mL氢氧化钠（4.3），小心提起玻璃塞之之流入反应室，将玻璃塞塞好，且在入口处加水密封，防止漏气。蒸馏4min降下锥形瓶（5.8）使冷凝管末端离开吸收液面，再蒸馏1min，用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液均流入锥形瓶内，然后停止蒸馏。

　　注：7.1.2.1和7.1.2.2蒸馏法测定结果相近可任选一种。

　　附录：蒸馏步骤的检验

　　精确称取0.2g硫酸铵（4.8），代替试样，按7.1.2或7.2.2步骤进行操作，测的硫酸铵含氮量为21.19±0.2%，否则应检查加碱、蒸馏和滴定各步骤是否正确。

　　7.1.3 滴定

　　用7.1.2.1或7.1.2.2法蒸馏后的吸收液立即用0.1mol/L（4.6.1）或0.02mol/L（4.6.2）盐酸标准溶液滴定，溶液由蓝绿色变为灰红色为终点。

　　7.2 推荐法

　　7.2.1 称取0.5~1g试样（含氮量5~80mg）准确至0.0002g，放入消化管中，加2片消化片（仪器自备）或6.4g混合催化剂（4.2），12mL硫酸（4.1），于420℃下在消煮炉上消化1h。取出放凉后加入30mL蒸馏水。

　　7.2.2 氨的蒸馏

　　采用全自动定氮仪（5.11）时，按仪器本身常量程序进行测定。
　　采用半自动定氮仪（5.11）时，将带消化液的管子插在蒸馏装置上，以25mL硼酸（4.4）为吸收液，加入2滴混合指示剂（4.5），蒸馏装置的末端要浸入装有吸收液的锥形瓶内，然后向消煮管中加入50mL氢氧化钠溶液（4.3）进行蒸馏。蒸馏时间以吸收液体积达到100mL时为宜。降下锥形瓶，用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液均需流入锥形瓶内。

　　7.2.3 滴定

　　用0.1mol/L的标准盐酸溶液（4.6.1）滴定吸收液，溶液颜色由蓝绿色变成灰红色为终点。

　　8空白测定

　　称取蔗糖0.5g代替试样，按第七章进行空白测定，消耗0.1mol/L盐酸标准溶液（4.6.1）的体积不得超过0.2mL。消耗0.02mol/L盐酸标准溶液的体积不得超过0.3mL。

　　9分析结果的表述

　　9.1 计算见下式：

　　粗蛋白质（%）= （V2-V1）×C×0.0140×6.25×V×100/m×V:
　　式中：V2--滴定试样时所需标准盐酸溶液体积，mL；
　　V1--滴定空白所需标准盐酸溶液体积，mL；
　　C--盐酸标准溶液浓度，mol/L；
　　m--试样质量，g；
　　V--试样分解液总体积，mL；
　　V:--试样分解液蒸馏用体积，m/L；
　　0.0140--每毫克当量氮的克数；
　　6.25--氮换算成蛋白质的平均系数。

　　9.2 重复性

　　每个试样取两个平行样进行测定，以其算术平均值为结果。
　　当粗蛋白含量在25%以上时，允许相对偏差为1%。
　　当粗蛋白含量在10%~25%之间时，允许相对偏差为2%。
　　当粗蛋白含量在10%以下时，允许相对偏差为3%。