三、胚胎体外生产技术

　　胚胎体外生产是相对于超数排卵体内生产胚胎而言的，是指卵母细胞在体外成熟后与获能的精子受精并分裂发育到桑椹胚或囊胚期（5～7天）的技术，包括卵母细胞体外成熟（IVM）、体外受精（IVF）和体外培养(IVC)。体外生产的胚胎简称IVF胚胎，目前20多种哺乳动物体外受精获得成功，其中兔、大鼠、人、牛、小鼠、山羊、绵羊以及猪等已产生出正常后代。体外受精可大量利用卵巢内的卵子，可提供更多的低成本胚胎，并且IVF胚胎可以冷冻保存，在肉牛业中，该项技术有着广泛的应用前景。但是目前IVF胚胎的移植妊娠率还比较低，尤其是冷冻后胚胎移植妊娠率更低，限制了其在生产中的大规模应用。

　　四、精子分离技术

　　家畜的精液中含有X和Y两类精子，而X精子体积和重量比Y精子大，经测定牛的X和Y染色体面积各为7.85平方微米和3.47平方微米，两种精子的DNA含量差异范围为2.4％～4.5％。因此可以根据X和Y精子DNA含量、电荷、体积、重量或比重等差异，分离X和Y精子，主要方法有沉淀法、密度梯度离心法、电泳法、柱层析分离法、流式细胞分离器分离法及H-Y抗原法。

　　五、胚胎性别鉴定技术

　　胚胎性别鉴定是指利用一定的方法鉴别早期胚胎（受精后5～7天）的性别，然后根据需要选择并移植某一性别的胚胎。

　　胚胎鉴别的主要方法有：

　　1．细胞学方法 即染色体核型分析法。将有丝分裂中期的染色体通过固定、染色、带型分析，可以找到X或Y染色体，这种方法的准确率几乎为100%但太费时，实验条件要求较高。

　　2．免疫学方法即利用H—Y抗原进行胚胎性别鉴定，有两种方法：

　　（1）细胞毒性分析法将胚胎培养在H—Y抗血清的培养基上，具有H—Y抗原的胚胎细胞被溶解，可判为雄性。这种方法实际上是将雄性胚胎处死，只留雌性胚胎移植或发育。

　　（2）免疫费光分析法先将胚胎与H—Y抗体反应30分钟，然后与用荧光物质标记的LgM抗体反应，再在荧光显微镜下检查，带有荧光来者判为雄性。这种方法则无需杀死胚胎，只从胚胎上取活体组织即可测定。

　　3．PCR法：是20世纪80年代发展起来的一种新方法，这种方法首先需要合成一对牛Y染色体特异性片段引物，然后从胚胎上取下少量胚胎细胞（3～5个细胞），应用PC方法在体外扩增牛雄性特异性片段，在紫外灯下观察是否出现特异性的扩增条带，结果呈现阴性，则胚胎判为雄性，若为阴性，则判为雄性。

　　六、人工诱导双胎技术

　　牛是单胎动物，在自然状态下，牛的双胎率为0.5％～4.5%，如黑白花奶牛双胎率为2.4%～3.4%，西门塔尔牛为5.2%，夏洛来牛为6.6%。应用胚胎移植诱导双胎可以使一头母牛的繁殖力提高一倍，母牛产犊效率提高，降低了每头犊牛的成本，对于发展肉牛业具有重要的意义。

　　人工诱导母牛双胎途径有：

　　1．遗传选择双胎这一经济性状的遗传力很低（0.043±0.012）。通过遗传选择来提高双胎率，不仅进展缓慢，而且是非常困难的。目前通过选种来增加双胎率的尝试，尚未获得成功。

　　2．外源激素的诱导就是利用外源促性腺激素刺激母牛卵巢上多个卵泡发良并成熟排卵，受精妊娠。常用的促性腺激素有孕马血清促性腺激素（PMSG）、促卵泡激素（FSH），目前国内也有利用抑制素抗血清免疫母牛的。

　　利用激素达到双胎的方法，目前存在的问题，是在同样的低剂量激素作用下，母牛的排卵反应存在着个体之间的巨大差异，常发生一个子宫角有两个以上胚胎的情况。牛的一侧子宫对维持一个以上的胚胎，具有明显的对抗性，而牛胚胎极少能从一个子宫角迁移到另一侧子宫角。在这种情况下，会出现流产，难产、胚胎死亡和影响产后泌乳量等问题。所以当一个卵巢排两个卵时，大多数情况只能产一犊。因此在找到控制每侧卵巢各排一个卵的方法之前，这种获得双胎的方法还不能在生产中大规模的采用。

　　3．胚胎移植

　　(1)人工授精结合胚胎移植就是在母牛发情配种时的6～7天，在黄体对侧子宫角移植一杖胚胎，以达到双胎的目的。

　　(2)移植两杖胚胎 即在发情后6～7天母牛两个子宫角各移植一杖胚胎，这是目前取得双胎的最佳方法。当每个子宫角移植一个受精卵的时候，有72%母牛怀胎，其中有73%产双胎，其受胎率和自然受胎率相同，但可比自然受胎几乎多产73%的犊牛，这样就大大提高了母牛的繁殖力。（昝林森）