安定(Diazepam)系国家控制的精神药品，具有抗焦虑、镇静、催眠等药理活性。在动物饲养和运输过程中使用，可降低动物的维持需要，减少途中失重和死亡率。某些不法者受到利益驱使常在饲料中添加使用，在动物组织中残留而导致畜产品不安全，因此我国农业部严令禁止安定用于饲料。

　　目前国内还没有对饲料中安定的检测方法，建立对饲料中安定的快速、准确、可靠的测定方法，打击违法使用安定已迫在眉睫。我们应用高效液相色谱法分析饲料中的安定，采用液-液分配结合固相浓缩、净化，外标法定量，具有回收率、灵敏度高和稳定性好等特点。

　　1 材料与方法

　　1.1 仪器岛津LC-6A、SPD-6A紫外检测器、C-R3A数据处理器、CL3R离心机、LAB4000旋转蒸发器、SCQ-l00超声波仪、Supelco固相萃取装置、固相萃取柱(Florisil,3mL/200mg)

　　1.2 试剂和药物

　　1.2.1 试剂二氯甲烷、正己烷、醋酸铵、无水碳酸钠(AR)、乙腈(HPLC淋剂)，所用溶液均为重蒸水配制。

　　1.2.2 安定含量99.50%，光谱检测合格，司法部司法鉴定科学技术研究所提供。工作液制备:20.0mg安定溶于甲醇中，定容至100mL,制定200μg/mL 贮备液，再依次用甲醇稀液制成2.0,1.0,0.50,0.25,0.10,0.05μg/mL的工作液。

　　1.3 试验方法 1.3.1 色谱条件色谱柱CLC-ODS(250×4.6mm,5μm)；流动相:25mmol/L醋酸铵:乙腈=50:50(V/V)；检测波长254nm；柱温40℃；流1.0mL/min；进样量20μL。

　　1.3.2 标准曲线绘制以浓度由小到大的次序，分别进样0.05,0.10,0.25,0.50,1.00，2.00μg/mL的工作液，按上述色谱条件用HPLC仪检测，得到色谱图，根据峰面积倍比关系及保留时间确定样品峰。

　　1.3.3 样品预处理称取5.0g饲料加入30mL蒸馏水，用10%碳酸钠溶液调节pH=10。用30mL正己烷一二氯甲烷(5:3V/V)分两次萃取，取有机相15mL，过 Florisil小柱，用3mL二氯甲烷洗柱，最后用甲醇1mL洗脱，收集洗脱液，供HPLC分析。

　　1.3.4 样品回收率及精密度测定取空白饲料5.0g，定量加入安定对照品，制成O.5,1.0,2.0μg/g三个浓度，按样品制备方法处理后，HPLC检测。

　　1.3.5 检测限测定将安定对照品分别加入空白饲料中，使每克饲料含安定O.002,0.005，0.010,0.020,0.050μg，按样品制备方法处理后，HPLC检测，观察出现安定色谱峰的饲料药物浓度。

　　2 结果

　　2.1 标准曲线 各浓度的安定工作液在选定的色谱条件下用HPLC测定，得到标准曲线回归方程: Y=49095.22X+648.86； 相关系数r=0.9999 其中:Y代表峰面积； X代表安定工作液浓度(μg/mL)。

　　2.2 色谱图在本试验选定的色谱条件下，将安定工作液用HPLC测定，测得安定的保留时间约为12.5min，色谱峰峰形较佳（图略）。

　　2.3 样品回收率见表1。

　　2.4 检测限在本试验的色谱条件下，信噪比为3时，安定的最低检测浓度为0.01μg/g。

　　3 讨论

　　3.1 生物样品中安定的提取方法通常采用液一液萃取、固相萃取及固相微萃取，考虑到饲料样品组分的复杂性，本试验采用液一液萃取结合固相萃取方法，实现提取、净化和浓缩三重目的。液一液萃取考察了正己烷与二氯甲烷不同配比对提取率和干扰情况的影响，以5:3时提取率较高，且易实现有机相和无机相的良好分层。安定在酸性、中性水溶液中不稳定，因此本试验确定在pHlO下提取。为了进一步消除干扰物质，本试验比较了氧化铝小柱和Florisil小柱对提取液浓缩、净化的效果，结果Folridil小柱净化效果较好。表1安定回收率测定结果添加浓度(μg/g) 实测浓度(μg/g) 回收率(%) 变异系数(%) 0.50 0.47±0.013 87.40±2.62 3.00 1.00 0.880±0.024 88.00±2.42 2.75 2.00 1.818±0.058 90.90±2.88 3.17

　　3.2 文献报道HPLC测定安定常用甲醇与水溶液作为流动相，本试验作了比较研究，发现用乙腈与水溶液作为流动相分离更好，本试验以25mmol/L醋酸铵作为水相，分离效果获得很好改善。

　　3.3 本方法为检测饲料中安定提供了一种准确、快速、方便和经济的测试手段，有利于饲料中药物和违禁药品监测工作的开展。