半胱胺盐酸盐对仔猪胃黏膜细胞H+-K+-ATPase活性和生长抑素表达的影响

　　(南京农业大学农业部动物生理生化重点开放实验室,江苏南京210095)

　　胃酸分泌是由胃组织中壁细胞来完成的,H+-K+-ATP酶(H+-K+-ATPase),又名质子泵,在胃酸分泌过程中起着关键作用。它通过自身磷酸化和去磷酸化,将细胞外液中的K+转运入细胞内,同时逆浓度梯度将细胞内的H+泵出细胞外,完成H+/K+电中性跨膜离子转运和胃酸分泌功能。H+-K+-ATPase专一性的存在于壁细胞中,H+-K+-ATPase的活性增强,胃酸分泌能力也相应增加,反之则相反。目前人们常以胃液的pH来判断胃的泌酸功能,但由于胃液的酸度受到食糜和胃其他分泌物的影响,这个指标并不能完全反映胃自身泌酸能力的强弱。因此,H+-K+-ATPase不仅可以更精确客观地衡量胃酸分泌能力,同时也是所有胃酸分泌调控途径的最后作用靶点。在人医临床上已开发了许多抑制H+-K+-ATPase活性的药物,如奥美啦唑、兰嗦啦唑等,用来治疗胃酸分泌过多症,而对增强H+-K+-ATPase活性的药物研究相对较少。仔猪腹泻给养殖业带来了巨大损失,而胃酸分泌不足是导致仔猪腹泻的重要原因,如何有效地促进胃酸分泌是人们关注的热点。

　　半胱胺(cysteamine,CS)是生长抑素(somatostatin,SS)的耗竭剂,它通过破坏SS半胱氨酸残基上的二硫键,使SS生物活性和免疫活性丧失,从而解除SS对胃酸分泌的抑制作用,促进胃酸分泌。尽管已有很多关于CS的报道,但在畜牧上大多集中在CS的促生长作用上,而CS对仔猪胃酸分泌调节的研究尚未见报道。在人医临床上CS对胃酸分泌调节的研究大多以鼠为动物模型,并且以整体实验为主,而体外研究的报道较少。在整体情况下,影响胃酸分泌的神经体液因素很多并且很复杂,而体外条件下细胞不受体内复杂内环境的影响,细胞周围的环境也易于控制,因此结合体外试验能更好地研究胃酸分泌的调节。不论是体内还是体外试验,都还未见CS对H+-K+-ATPase表达和活性影响的报道。因此,本试验通过半胱胺盐酸盐(cysteaminehydrochloride,CSH,有效成分是CS)处理体外培养的仔猪胃黏膜细胞,探讨CSH对H+-K+-ATPase表达和活性的影响,并同时观察SS表达的变化,以期在细胞和分子水平深入揭示CS对仔猪胃酸分泌功能的调节及其可能的作用机制。

　　1材料与方法

　　1.1实验材料和试剂

　　28日龄哺乳期健康仔猪购自江苏农科院实验猪场,体质量8kg左右。CSH(Sigma公司,M6055,纯度>98%)。DMEM高糖培养基(Gibco),胎牛血清(杭州四季青公司),胰蛋白酶(Amresco),细胞培养板(Costar)等。

　　1.2胃黏膜细胞培养

　　参照Terano等方法并稍作调整。仔猪宰杀后,迅速取出胃,用4℃含5倍于正常浓度双抗生素(青霉素100U/mL和链霉素100g/L)的D-Hanks液洗去胃内容物,分离胃底和胃窦黏膜,将黏膜剪成1mm3左右的小块,用加正常浓度双抗生素的0.15%胰蛋白酶37℃消化5次,每次20min,100目网筛过滤,滤液以1000r/min离心10min,沉淀以Hanks液悬浮,再重复离心1次,最后沉淀以DMEM高糖培养液(含胎牛血清10%,青霉素100U/mL和链霉素100g/L)制成细胞悬液,用0.1%台盼蓝染色检测细胞存活率在90%以上。将细胞调整至1×106个/mL,接种到6孔培养板上,然后将细胞放入CO2培养箱中进行培养(37℃,5%CO2)。

　　1.3细胞分组及处理

　　1.3.1测定基因表达的细胞处理及细胞总RNA的提取

　　细胞用6孔培养板培养,细胞分为4个组,每组4个样本,每个样本6孔。细胞培养24h后,更换培养液。其中对照组用基础培养液,试验组分别在基础培养液中按0.001g/L(低水平)、0.01g/L(中水平)、0.1g/L(高水平)剂量添加CSH。继续培养20h。培养结束后,吸去培养液,采用硫氰酸胍-酚-氯仿一步法[10]提取细胞总RNA,用紫外分光光度计测定总RNA浓度(260nm),并通过变性琼脂糖电泳检验总RNA的质量。以上实验重复2次。

　　1.3.2测定H+-K+-ATPase活性的细胞处理

　　细胞分为4组,每组6个样本,每个样本1孔。细胞分组、细胞培养液、培养过程及添加CSH的剂量与上一步完全相同,在培养结束后,吸去细胞培养液,每孔加1mL0.2%的TritonX-100破碎细胞,收集细胞破碎液,放入-20℃冰箱待测酶活性。以上实验重复2次。

　　1.4相对定量RT-PCR(semi-quantitativeRT-PCR)

　　1.4.1反转录(RT)

　　用随机引物Randomhexamerprimer对所有样品的RNA进行RT。RT反应总体积25μL,包括2μg总RNA,20URNA酶抑制剂,100UMMLV反转录酶,5μL5×RTbuffer(含250mmol/LTris-HClpH8.3,375mmol/LKCl,15mmol/LMgCl2,50mmol/LDTT),0.4mmol/LdNTP,4μmol/L随机引物。先加RNA模板,dNTP和随机引物,75℃变性5min,立即放冰上冷却,再加其余试剂37℃反应60min,95℃灭活5min。

　　1.4.2引物设计及PCR扩增条件

　　H+-K+-ATPase和SS引物根据GenBank(M22724和U36385)提供的猪H+-K+-ATPasecDNA、SScDNA序列设计。H+-K+-ATPase的上游引物:5′-gagaaccaccacctacaag-3′,下游引物:5′-caacagcgaactccaag-3′;SS的上游引物:5′-agctgctgtctgaacccaac-3′,下游引物:5′-gaaattcttgcagccagctt-3′。引物由大连宝生物工程公司合成。采用18SrRNA作内标,以校正加样和扩增效率的误差。分别对PCR反应条件、循环圈数以及目的基因引物和18S引物的比例等进行优化。PCR反应体积25μL,含2μLRT产物,0.5UTaqDNA聚合酶,5μL10×PCRBuffer(含50mmol/LTris-HClpH9.0,100mmol/LNaCl,1.0mmol/LDTT,0.1mmol/LEDTA,50%glycerol,1.0%TritonX-100),0.2mmol/LdNTP,1.0～2.0mmol/LMgCl2,0.7μmol/L(H+-K+-ATPase)或1.6μmol/L(SS)目的基因引物,1.0～2.6μL18SrRNA内标。最后确定H+-K+-ATPase的PCR反应条件为:94℃预变性5min;94℃变性30s,54℃退火30s,72℃延伸30s,24个循环;72℃延伸8min。SS的反应条件为:94℃预变性8min;94℃变性30s,55℃退火40s,72℃延伸40s,26个循环;72℃延伸8min。产物置4℃冰箱待测。PCR反应在GeneAmpPCRsystem9600型(PerkinElmer,USA)上进行。分别用水和不经过反转录的RNA样品作为对照进行PCR反应,用于检测反应体系中是否有外源DNA或基因组DNA污染。

　　1.4.3电泳及灰度分析

　　取20μLPCR产物在含EB的2.0%琼脂糖凝胶上电泳。图像处理及灰度分析用KodakIDElectropheresisDocumentationandanalysisSystem120(KodakPhotoFilmCo.,Ltd.,USA)进行,根据目的基因和18SPCR产物的灰度比,确定样品中H+-K+-ATPase和SSmRNA表达的相对含量。

　　1.5H+-K+-ATPase活性测定

　　按试剂盒说明进行测定,试剂盒购自南京建成生物工程公司。主要步骤为将细胞裂解液以1000r/min离心10min吸上清,然后添加H+-K+-ATPase激活剂,45℃温浴10min,最后用紫外分光光度计测定样品中磷的含量,另外用考马斯亮蓝法测定细胞中总蛋白含量,结果以反应1h内H+-K+-ATPase磷酸化释放磷量和细胞中总蛋白含量比值来表示H+-K+-ATPase活性,单位为每小时每克总蛋白中释放多少毫摩尔的磷表示(mmol·g-1·h-1)。1.6数据统计与分析所有数据用平均值±标准误表示。采用SPSS11.0forWindows统计软件中LSD检验组间差异显著性。

　　2结果

　　2.1CSH对培养的仔猪胃黏膜细胞H+-K+-ATPase表达和活性的影响

　　低水平的CSH处理后H+-K+-ATPasemRNA的相对丰度(0.73±0.11)与对照组(0.75±0.06)相比没有显著变化(P>0.05),中、高水平CSH处理后H+-K+-ATPasemRNA的相对丰度(1.02±0.07,1.08±0.09)都显著高于对照组(P<0.05),。低水平的CSH处理后H+-K+-ATPase活性(1.53±0.08)与对照组(1.60±0.10)相比也没有显著变化(P>0.05),而中、高水平的CSH处理后H+-K+-ATPase活性(2.40±0.21,2.34±0.26)都显著高于对照组,分别比对照组提高了57%和53%(P<0.05)。

　　2.2CSH对培养的仔猪胃粘膜细胞中SSmRNA表达的影响

　　低水平CSH处理细胞时,试验组SSmRNA的相对丰度(0.85±0.06)与对照组(0.77±0.06)相比没有显著的变化(P>0.05),但中、高水平CSH处理后SSmRNA的相对丰度(1.17±0.13,1.17±0.15)都显著高于对照组(P<0.05).

　　3讨论

　　H+-K+-ATPase在mRNA表达水平和蛋白质水平均呈明显的发育性变化。Yang等于19日龄大鼠胎儿胃底腺中检测到H+-K+-ATPase的活性,并发现该酶的活性随日龄的增加而增加,进一步研究表明该酶mRNA的表达和蛋白水平也随日龄的增加而增加;对25～42周龄的人胎儿研究发现,25周龄的胎儿胃中即可检测到H+-K+-ATPase的表达,并且随着胎龄的增加表达也显著增加。

　　以上研究表明,新生动物H+-K+-ATPase的表达和活性都较低。在猪上还未见H+-K+-ATPase表示和活性的发育性变化的报道,我们推测仔猪胃酸分泌不足可能与H+-K+-ATPase的活性较低有关,因此通过增强H+-K+-ATPase活性可能是促进仔猪胃酸分泌的有效方法。胃酸分泌受到体内多种激素的调节,其中胃组织D细胞分泌的SS通过抑制胃泌素和组胺的分泌间接抑制H+-K+-ATPase的活性,对胃酸分泌起抑制作用,但SS是否通过直接抑制H+-K+-ATPase的表达和活性来抑制胃酸分泌还没有实验证实。CS通过破坏SS半胱氨酸残基上的二硫键,使SS生物活性和免疫活性丧失,促进胃泌素和组胺分泌,使胃酸分泌增加。用CS静脉灌注或皮下注射大鼠,结果发现血浆胃泌素的浓度、胃组织中组胺含量、胃酸分泌量都显著增加。CS能明显提高香猪胃泌素水平(P<0.01),促进胃液分泌。但CS对H+-K+-ATPase的表达和活性有何影响还未见报道。我们的试验表明,在体外条件下,低水平的CSH对H+-K+-ATPase的表达和活性没有影响,中、高水平的CSH可增强H+-K+-ATPase的表达和活性,因此我们认为一定水平的CS可通过增强H+-K+-ATPase的表达和活性来促进仔猪胃黏膜细胞分泌胃酸。

　　传统观点认为,CS的作用与细胞SS水平的降低有关,但我们却发现在中水平和高水平时,CSH提高了SSmRNA的表达。我们推测可能是CS耗竭SS,而后者浓度的下降可能反馈性地促进其合成,因此其mRNA表达升高。Kanayama等发现SS自身可以调节SSmRNA的表达;Papachristou等也认为CS耗竭SS后,SSmRNA的上调可能与SS的反馈性自身调节有关。

　　综上所述,我们的试验表明CSH可增强体外培养的仔猪胃黏膜细胞H+-K+-ATPase的表达及活性,而这一作用可能通过SS介导,而其他胃液分泌调节因子,如胃泌素和组胺,是否也参与CSH对H+-K+-ATPase表达及活性的调节,还有待进一步研究。