New Page 1车丽娟 荣立南

动物繁殖技术是生物技术的重要分支。传统的生物技术革新换代是从20世纪70年代初期开始的。分子生物学的某些突破使人们能够分离基因，并在体外进行重组。这些突破迎来了生物技术的时代。作为繁殖技术从20世纪50年代人工授精技术到70年代胚胎移植技术的应用，似乎才真正开始动物繁殖技术的新纪元。本文在这里集中阐述了人工授精技术（AI），发情控制，体外受精，性别控制，胚胎低温保存，无性繁殖（克隆），胚胎分割和融合技术7个方面的动物繁殖技术的进展。

1家畜的人工授精（AI）

人工授精是家畜繁殖应用最为广泛的一项技术。近年来，人工授精头数逐年增加。人工授精数量大，普及率高的是欧洲、北美及日本等经济发达国家。在人工授精技术中，精液的保存，精子活力的测定，授精技术又有新进展。

1．1期精液的保存

1948年发现，在保存液中添加甘油能使精子在冷冻和解冻后仍保持受精力。这个发现使精液的保存进入一个新的阶段。精液的保存目前大多以细管冷冻精液为主。

用于冻精的保存液力求配方简化。有人认为牛的冷冻精液用脱脂奶稀释保存既经济又效果好。1976年保加利亚试验结果证明脱脂奶和乳糖混用效果更好。在稀释液添加剂中除常用的甘油外，最近日本从大蒜中提取一种维生素B的衍生物TPD（Thiamin Propyl Disulfide，丙二硫化硫胺，新维生素B1），据称对保存精液有良好作用。在冻清稀释液中加入Tris（三羟基甲基氨甲烷）已广为应用。此外，二甲基亚砜（DMSO），乙二胺甲乙酸钠（EDTA），聚乙烯吡（咯烷）酮（P．V．P），乙烯二醇等也被采用。英国试用0.025％低浓度甲醛加入稀释液中，发现对精子的脂膜在冷冻时能起到保护作用。

家畜精液冻干的研究近年来取得了进展，美国E．V．拉尔森等人将牛精液冻成颗粒，抽干至含水量25％，在25℃常温下保存约一个月，然后授精，受胎率达34％。如果冻干精液在技术上全面突破，将给家畜人工授精技术，再一次带来革命。但是，目前在测定各公畜精液耐冻性的问题还没完全解决，这将会影响冷冻方法的改善。

冷冻精液保存期是很长的，依据理论可以无限期保存。

1．2精子活力的测定

精子活力的测定通常使用的是流式细胞分类器。现已证明，有几种荧光染料用于染色精子，以适当波长的光激发，可以较准确的评定精子的活力。Centla（1990）提出用不同染色方法能测定精液中死活精子的比例。但是更应该用测定顶体完整的精子和有顶体反应精子数量来评定精液质量。

为了深入观察精子活力、运动状态以及细微结构，近年来出现了显微镜萤光屏法、显微电视录相法。德国又研究出记波照相法、加拿大研究出光子对射分光镜法、以及日本的电摄影计算光扩散技术。这些高精密度的仪器都是研究精子生理生化和冷冻精液基础理论方面最新的实验手段。

1．3授精技术

通过子宫颈在子宫内授精技术在牛和猪上是有效的。腹腔镜子宫内输精已被广泛应用在绵羊和山羊繁育上。然而该技术操作时相对较慢，而且费力、费用高。现已报道了通过子宫颈的宫内输精方法和背卧式子宫操作法，但是并没有达到广泛应用。

2发情控制

2．1发情周期的调节（同期发情）

用孕激素处理母牛不超过14d，不会使受路精降低。但是还需配合使用溶黄体制剂对母牛同期发情有效。20世纪70年代以来，家畜同期发情技术已成为许多国家研究的重要课题之一。研究的内容十分广泛，包括种类繁多的孕激素药物，前列腺素、促性腺激素、释放激素以及其它制剂的效能测定和投药方式，处理期限等。近年来由于前列腺素及其类似物合成制剂的发展和释放激素合成制剂的应用，使家畜同期发情研究向广深发展。

2．2排卵控制

Smith和 Engle （1927）首先发现了超排现象。Cole和Hart（1930）发现孕马血清可使未成熟的大鼠超排，以此奠定了超排的基础。孕马血清促性腺激素（PMSG）与另两种垂体促性腺激素促卵胞素（FSH）和促黄体素（LH）具有相似的生物活性。这些使家畜超排的促性腺激素制剂引起人们的重视，但却存在着以下3个问题：①制备中效价不精确。目前，家畜用FSH制剂的生物活性还没有统一的标准，所以难于对不同厂家的产品进行直接比较；②激素制剂的生物半衰期不一致性。PMSG半衰期长，通常牛卵巢上有大量卵泡产生，但大多数不排卵；FSH半衰期短，卵泡产生的数量不多，但可利用的卵泡多。比如循环系统中PMSG的半衰期，在小鼠体内是6h，大鼠是24h。这种差异可能是由于试验动物的种属或分析方法的不同，也可能是激素制剂在体内糖基化程度不同而导致；③FSH和LH之间的比率影响超排。Murphy等（1989）比较了几种商业制品中FSH与LH的比例，发现其中存在着批次之间的差异而引起超排效果的不同。Arm－strong等（1984）在使用LH／FSH制剂量最低，对绵羊进行超排处理，结果超排率和胚胎产量高。Chupin等（1985）对不同品种的牛试验的结果表明：不同LH／FSH的比例超排反应不同，发现夏洛来与荷斯坦牛在使用LH／FSH比例高的FSH制剂，尤其是在不含LH时，均产生高效的超排效果。迫其原因可能是牛体内的LH水平足以提供与外源FSH协同作用所需的供诱导超排LH量。

3体外受精

3．l卵母细胞的体外成熟

卵母细胞成熟是母牛体外受精的关键环节。卵母细胞在进行体外培养时，同时添加促卵泡素和LH排卵高峰8h和20h的卵泡液能有效地改善卵母细胞成熟度。目前，常用的培养液有TCM199，Ham’F10和Ham’sF12，在这些培养液中还应加入犊牛血清，或发情牛血清，或牛血清白蛋白及激素等。

3．2精子体外获能

精子获能和顶体反应是家畜体外受精过程的重要一环。近年来，用肝素（Heparin）、钙离子载体（Iono－phoreA23187，I－A）和咖啡因（Coffeine）、高离子强度法、高pH处理法及添加牛卵泡液BFF、猪卵泡液PFF、子宫液、输卵管液诱导家畜精子体外获能的研究十分活跃，并取得了试管后代。目前，用肝素诱导牛精子体外获能其重复性之好于其它方法。肝素对其它家畜精子同样有效。

3．3体外受精显微操作

利用附睾尾部精子进行体外受精时，受精率在种子公牛之间没有差异。而利用射出精子进行体外受精时个体差异大。显微受精是在体外成熟的卵母细胞和体外获能精子的结合。目前，显微受精有以下3种方法：①透明带开孔法，它包括机械法；用微型玻璃针切开并切除部分透明带；化学溶解法；先用透明质酸酶除去卵丘后，再用酸性Tyrode氏液溶解局部透明带；激光法：用波长193nm的氟化氩激光束可准确破坏透明带；②卵黄间隙精子注入法；③卵细胞质精子注入法。迄今，利用显微受精技术得的后代只有兔和牛。

4性别控制

20世纪90年代生物学的重大成就之一是发现哺乳动物决定雄性是在Y染色体上DNA片段的性别决定区（SRY）上的性别决定因子，以此为依据，就有了性别控制的两个途径。

4．1受精卵的性别控制

通过精子分离技术，将带X染色体和带Y染色体的两类精子分开或将其中决定某一性别的精子杀死，只保留决定另一性别的精子，这样受精卵的性别得到控制。牛通常用免疫磁力法分离X精子和Y精子，这是一种快速经济获得接近纯X精子群的方法。猪的精子分离是用荧光染料Hoehst33342染色，再用流式细胞分类器分类。

4．2胚胎的性别鉴定

B．Avery （1991）报道，根据体外受精后发育速度鉴别牛胚胎性别；早期的染色体组型分析法和DNA探针法鉴定性别；此外还有免疫学方法。

5胚胎的移植及胚胎低温保存

胚胎移植的宗旨是从优良的母畜那里获得更多的后代，以提高遗传进展。

5．l胚胎的移植

受精卵移植已陆续在兔、羊、猪、牛、马等家畜中获得成功。大家畜的非手术取卵和移卵技术已取得成功。用非手术法移卵有两种方法：①用移卵器通过子宫颈直接插到子宫角；②用阴道穿刺法。整个手术仅5－10min。一般来说，用非手术法移卵不如手术成功率高，因为容易损伤子宫角引起炎症，使胚胎不能顺利附植。非手术法成功率为25％－45％，而手术法可达 60％～65％。

5．2胚胎冷冻保存

胚胎冷冻保存技术由初始的缓慢冷冻发展到快速冷冻、一步冷冻、直接移植冷冻、及玻璃化冷冻。M．Kasai（1994）报道玻璃化冷冻用乙二醇，水溶性聚蔗糖，蔗糖的混合液代替以二甲基亚视等玻璃液能较大程度减少溶液的溶性。G．Vajta等（1995）报道，体外受精发育成的半囊胚玻璃化冷冻后，采用细管内直接脱除冷冻剂的效果好。对于牛和兔来说，胚胎的低温保存已属常规技术。对于猪来说，H．Nagashima等人（1994）报道，因猪胚不耐冻，所以对猪胚进行脱脂，以降低胚胎温度敏感性。

6无性繁殖（克隆）

动物克隆即细胞核的移植。Spreeman（1938）定义胚胎细胞核移植技术是指将一个多细胞胚胎的卵裂球或细胞核，通过显微手术和细胞融合的方法，移植到一个去核的卵母细胞或去核的受精卵中，构成新胚胎（克隆胚胎），然后移植给受体，获得与核供体胚胎基因型相同的后代（克隆动物）的生物技术。采用细胞核移植的方法把受精卵的基因全部置换，是基因工程在家畜品种改良中发展起来的一个重要途径。直到1952年，Briggs和King首次获得两栖类美洲豹蛙的胚胎核移植后代，而Wilmut等（1997）获得了成年绵羊乳腺上皮细胞核的克隆后代这一突破性成果，翻开了动物克隆新一页，为动物完整复制打下了基础。

尽管核移植的平均效率已经有了很大提高，但大规模生产具有优良牲状、理想性别和遗传一致性的克隆动物之前，仍有许多问题有待解决。所面临的问题不是能否克隆，而是如何提高整体效率。除需进一步完善核移植技术——去核、融合、激活和培养技术外，还需研究利用那些成本低，容易观察的体外成熟的MⅡ卵母细胞作受体，以提高核与质的相容性。进一步研究开发核源，尤其是胚胎于细胞技术，是获得大量遗传上完全相同核供体细胞的途径。

7胚胎分割和融合（嵌合体技术）

7．1胚胎分割

胚胎分割技术是显微操作技术，分割胚胎内细胞团（囊胚）、２－８个细胞卵裂球或晚期桑格胚（32个细胞）。把分割的胚胎每一份直接移植到受体囊胚或与8－10细胞时期的胚胎聚集，由此发育成的家畜个体为嵌合体。

7．2细胞融合

细胞融合是家畜育种的一项新技术，它是人为地用物理的方法使细胞融合，得到新的杂种细胞，是家畜育种的一项新技术。在融合细胞中有2核与3核，而4核以上的杂种难以增殖。当将两种细胞进行融合时，可出现同种细胞间融合细胞和异种细胞间融合细胞及不融合的细胞。细胞融合不仅在细胞核之间，在细胞质之间也发生混合。

嵌合体的制作方法是，先将两个植入前的胚胎除去透明带，然后将其融合在一起。嵌合的胚胎在体外培养后，即可移入受体。嵌合体从每个胚胎得到一些组织，当一个胚胎在遗传上是雌性，另一个是雄性时，就产生一个性嵌合体。通常这种性嵌合体转化为雄性个体。可是，嵌合体的组织是随机地从每个胚胎发育而来的，将来有可能控制胚胎的相对作用，从而任意的混合基因型。把奶牛的乳房和肉牛的肌肉，或把瘤牛的皮肤、肝腺和不同品种肉牛的其它特性合并，可得到在遗传上变异很大的新的仔代，其公牛6个月可完全成熟，母牛产奶量大大增加，一年可提供4.5万磅牛奶。

8结束语

对世纪，将是生物工程技术迅速发展日益完善的世纪，它会对传统的繁殖技术带来新的飞跃。我们相信，随着繁殖技术的发展完善，它将为人类建设美好的明天做出更大的不可替代的贡献。