泡盛曲霉引起南美白对虾黑鳃的报告
Velmurugan Karthikeyan 印度 2015年

　　摘要：南美白对虾是养殖最广泛的虾品种，跟其它虾一样都容易感染微生物继而发病。在本研究中，真菌泡盛曲霉KM434331引起了南美白对虾的黑鳃，这是首次在印度的泰米尔纳德邦，纳格伯蒂讷姆地区的Vellapallam的南美白对虾养成池塘中发现并报道。从病虾的鳃部分离出了泡盛曲霉 KM434331。此外，鉴定了它的形态、培养和系统发育特征。组织病理显示，它发生了炎症反应，出现了溶血性渗透、包被作用、黑化作用，胶原样纤维沉积在虾的鳃部。除此之外，泡盛曲霉KM434331引起鳃的功能性障碍，导致养成池塘虾的慢性死亡。
　

　　1、前言
    　

　　水产养殖是全球全球重要的经济活动（Kathiresan等，2012），为全球提供了三分之一的食物（联合国粮农组织，2009年）。南美白对虾是重要的经济养殖对虾之一，目前许多国家都在养殖它，尤其是在东南亚（Alcivar-Warren等，2007）。在南美白对虾的育苗和生产的过程中严格控制特定病原，以保证南美白对虾产业的正常进行。然而，目前贝类和有鳍鱼的养殖正在经受真菌感染的困扰(Khoa et al., 2005)。1969年Hubschman报道，shrimp Palaemonetes kadiakensis的幼体原发感染过水霉。黑鳃病首次是在美国龙虾上报道的(Lightner and Fontaine, 1975)。一般来说，黑鳃是由镰刀均属引起的，开始是鳃发生变色，而后才发展成黑鳃，最终导致感染物种的死亡(Khoa, 2005)。有报道表明，串珠镰刀菌在日本对虾的早期阶段，导致它鳃部的颜色略有变化，从不透明的白色变为有黑色的斑点。此外，串珠镰刀菌分生孢子经过肌肉接种，证明它可以引起虾黑鳃并导致虾死亡(Rhoobunjongde et al., 1991)。口虾蛄在实验室感染真菌和那些自然感染虾的病症相似。组织病理学研究表明，在鳃丝里面发现菌丝和分生孢子，在鳃丝和鳃基础结构上，菌丝和分生孢子被血细胞包围。结果证实，两种无性型真菌Plectosporium oratosquillae 和顶枝孢属是口虾蛄的致病菌(Duc et al., 2009)。然而，至今没有泡盛曲霉KM434331真菌感染南美白对虾导致黑鳃的报道。所以本研究首次报道了，从南美白对虾的黑鳃部位分离出了泡盛曲霉 KM434331。研究表明，泡盛曲霉KM434331是在半咸水的成虾养殖池塘中感染南美白对虾的鳃部。

　　2、材料和方法

　　2.2 样品采集
　　从2013年5月到2014年4月，通过抛网取黑鳃的12-16g南美白对虾。采集到30-45尾感染的虾，并对每尾虾带回实验室进行进一步研究。

　　2.3组织病理学研究
　　对濒死的感染真菌的虾的肝脏和肌肉注射戴维森固定液，防止其自溶。注射后，将整尾虾浸泡在戴维森固定液中48小时，之后再进行处理。将黑鳃的部分剪下，浸泡在戴维森固定液中48小时，之后转移至70％乙醇作进一步处理。此外，切面用苏木精和伊红染色，在40×的光学显微镜下观察切片，进行常规病理研究。

　　2.4 微生物学研究
　　黑鳃组织是从感染真菌的鳃部剪下来的，在40×的光学显微镜下观察。黑鳃组织用无菌生理盐水（0.85％NaCl）清洗3次，之后进行细菌分离，接种到沙氏葡萄糖琼脂平板上，并用两性霉素B和硫酸链霉素来抑制其它菌的污染。此外，将平板在25℃培养4天，之后25℃SDA斜面纯种扩增培养用于随后的实验。真菌菌株通过LPCB鉴定，形态通过光学显微镜观察。

　　2.5 扫描电镜（SEM）

　　2.6 分子鉴定和系统发育分析

　　3 结果

　　3.1 显微和组织病理学观察
　　南美白对虾黑鳃的外部临床症状就是鳃的外部显现呈黑色。图1为光镜下观察南美白对虾正常的鳃和感染虾虾鳃的真菌分生孢子被包被在鳃小叶中。图2 为组织学结果，有正常和病变虾鳃，病变虾鳃的血腔横切面显示，鳃小片里面包被了菌丝。且溶血性渗透使得大量物质外渗，导致凝固性坏死。

图1 （A）光镜下正常鳃（B）光镜下感染真菌虾的鳃外观

图2 （A）正常鳃小片（B）鳃组织血腔横切面，血细胞由大量凝固性坏死物质包围。
　　3.2 微生物学研究
　　SDA平板上的菌落颜色开始是灰色的，之后迅速变为明亮的浅绿色。分生孢子的梗粗糙起来，长至1mm长，呈松散辐射、独立和柱状分布。二层的，有些分生孢子头直接连接着瓶梗，里面有囊泡。瓶梗7-10×2-2.5微米;分生孢子通常呈球形或亚球形，偶尔椭圆形，明显粗糙，直径3-6微米，但大多小于4-5 微米的直径（图3）。

图3 （A）LPCB观察山泡盛曲霉KM434331成熟的分生孢子梗的显微照片。（B）LPCB观察显示分生孢子、分生孢子梗和泡盛曲霉KM434331。
　　3.3 扫描电镜
　　扫描电镜观察到了许多菌丝，泡盛曲霉KM434331菌落有分生孢子梗和分生孢子
头。分生孢子头通常呈辐射状，分裂成几个规则的列，偶尔柱状头，分生孢子为球形或
亚球形。其表面覆盖了大量的分生孢子和泡盛曲霉KM434331孢子（图4）

图4 （A）许多菌丝、成熟的分生孢子和泡盛曲霉KM434331的分生孢子梗的显微照片。（B）分生孢子覆盖整个分生孢子梗的表面。（C）盛曲霉KM434331孢子的照片。（D）电镜近距离观察盛曲霉KM434331孢子的照片。

　　3.4 系统发育分析
　　真菌泡盛曲霉通过进一步的18S rDNA检测和BLAST同源性分析，结果表明：分离出的casvk5（KM434331）与泡盛曲霉EU821242的相似度极高，为100%。此外，系统进化树分析表明，分离的单系群间分支的差异极小（图5 ）同时，进化树表明A. brasiliensis和A. usamii的亲缘关系较近。

图5 系统进化树显示，泡盛曲霉CASVK5 KM434331和其它曲霉属真菌的亲缘关系。

　　4 讨论
   

　　现代集约化水产养殖导致真菌病的感染在全世界的水产养殖业中大量暴发(Karthikeyan and Gopalakrishnan,2014)。本研究首次报道了，泡盛曲霉导致了南美白对虾成虾养殖池塘虾的黑鳃。目前对泡盛曲霉KM434331的分离和鉴别主要是通过形态学、系统发育、扫描电镜 和组织病理分析。泡盛曲霉是最普遍存在的种类，从虾分离的各种泡盛曲霉可占分离出来真菌的22% (Silva et al., 2011)。曲霉属广为人知，是因为它产生的黄曲霉毒素有致癌的可能(Lacaz et al., 2002)。霉菌病是罗非鱼的主要疾病(Olufemi, 1983)。推测这些真菌的感染是通过鱼饲料的污染传染的(Saleem et al., 2012)。腐皮镰刀菌造成网箱养殖龙虾的黑鳃，并且尝试恢复97只感染真菌之后黑鳃的龙虾(Nha et al., 2009)。然而，在日本对虾的黑鳃病变处分离出了串珠镰刀菌(Rhoobunjongde et al., 1991)。2009年Duc报道，口虾蛄的鳃部感染了枝顶孢属和P. oratosquilla两种变形的真菌。虽然，曲霉属被认为是鱼和虾的病原体，但还没有报道过它导致了虾的黑鳃。因此，这是第一次报道，从虾黑鳃的位置分离出了泡盛曲霉KM434331 。
    　

　　在本研究中，组织病理学表明，泡盛曲霉KM434331产生的致癌毒素，导致鳃部出现黑斑病灶。鳃部血细胞的被包被作用对虾的呼吸系统造成损伤，黑化作用将最终导致虾的死亡。然而，这个病理症状同另一个报道的真菌疾病很相似。里尔的Fe 2+离子吸收反应导致了黑斑病变(Brain and Egusa, 1981)。
   

　　SEM表明，泡盛曲霉KM434331菌落包含分生孢子梗、分生孢子头，分生孢子呈球形或亚球形，覆盖整个分生孢子梗表面。这同致病菌泡盛曲霉 BTMFW032相似（Beena et al., 2010）。系统进化树的结果表明，它与以前的泡盛曲霉的相似度为100%i(Basheeretal.,2011)。

　　5 结论
   

　　本研究可能是病原菌泡盛曲霉在南美白对虾养殖上的第一份报道。在南美白对虾的养殖过程中，发育不良容易感染疾病。当环境不良，如水源污染、高密度养殖、投料过多时，会感染泡盛曲霉。因此，南美白对虾养殖过程需要更规范、合理。尽管如此，本次调查对南美白对虾养殖中虾感染泡盛曲霉提供的详细的信息。
                                          
　　译者：利洋公司技术部　陈明卫