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双孢蘑菇常用发酵过的粪草或谷粒作原种栽培种的培养基。在粪草培养基上，菌丝洁白至苍白色，粗细均匀，后期出现菌索，上下均匀一致，无扇形变异，无菌被，在23℃恒温培养条件下，原种750毫升菌种瓶25～30天长满瓶，栽培种要早5天左右满瓶。谷粒种菌丝浓白粗壮，遇高温时微黄，上下均匀一致。如果生长中就有菌被形成，说明过湿，如果生长不均匀，表明浸泡和预煮时间不够。若生长中菌丝渐变黄，表明培养温度过高，要多方采取降温措施。在高温条件下(超过23℃)培养的菌种，使用时不易吃料，发菌慢。