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将接种后的试管置于恒温箱或培养室培养，培养室要尽量避光。培养期间，有条件的要求培养温度略低于菌丝生长最适温度，这样培养出的母种会更健壮，一般较菌丝生长最适温度低1～2℃。如木耳菌丝生长最适温度 26～28℃，而实际生产中常取25℃培养。培养期间还要求空气干燥，以大气相对湿度<75％为最好。在高温高湿的夏季，要特别注意防止高温削弱菌种的生活力和高湿造成污染。

培养期间要经常检查，及时拣出不良个体。培养期间主要检查两方面，一是有无污染，二是菌丝生长是否正常，包括形态、长速、活力、均匀度等。