1发病情况

    某场存栏生产母猪593头，产仔347头，其中弱仔4头，占1.2%，木乃伊18头，占6.95%，死胎51头，占14.7%。新生仔猪一周龄内死亡57头，占16.4%，断奶(30天)前死亡81头，占23.3%，共计损失211头。育成率为39.2%。母猪返情率20%。20%左右育肥猪发病，死亡8头。?

    2临床症状

    新生仔猪表现为被毛粗乱、体表苍白，精神委靡不振、消瘦、喘气、腹泻，拉黄色水样粪便，体温升高(40～41.5℃)。少数仔猪出现转圈、发抖、四肢呈划水状等神经症状。育肥猪呈犬坐式、腹式呼吸、喘气、体温升高(39～42℃)，全身发绀，严重的病猪口吐白沫、四肢呈划水状、鸣叫，最终衰竭而死亡。?

    3病理变化

    现场共剖检了6头仔猪，主要表现为：濒死仔猪脑膜充血、肿胀和出血。鼻黏膜肿胀、出血，有黏液流出；扁桃体肿大、充血直至溃疡。气管内有大量的渗出液。肺脏呈紫黑或暗红色变化、水肿、充血，表面出现大小不一的灰白色的化脓灶，横切面出现血样泡沫；胸腔积液，肺脏与心包、膈膜、胸腔壁相粘连。肾出现针尖大小、密集的出血点，肝脏出现灰白色坏死灶，脾脏无明显肿大和梗死现象。?

    4猪胸膜肺炎放线杆菌的分离和鉴定

    4.1病原菌分离无菌取濒死仔猪肺、咽喉扁桃体组织，接种到PPLO琼脂培养基上，置10%CO237℃培养，24h后观察到直径1～2mm透明、圆润的菌落。

    4.2涂片镜检取上述菌落沫片，经革兰氏染色，观察到单个成对的革兰氏阴性细小短球杆菌。?

    4.3病原菌的纯化用接种环挑取经镜检选择的单个菌落，在PPLO琼脂培养基上划线后，置10%CO2，37℃培养，24h后观察到透明、圆润、均匀的小菌落。

    4.4PCR扩增反应

    4.4.1模板的制备

    用接种环挑取数个纯化后的菌落至一含40μl无菌三蒸水的EP管中，100℃水浴5～10min，立即放入冰水混合物中，待完全冷却后，12000r/min离心3min，取上清4℃保存备用。

    4.4.2反应体系(50μl)10倍缓冲液5μl，25mmol/LMgCl?23μl，dNTPs1.0μl，1.5μmol/L上游引物1.5μl，1.5μmol/L下游引物1.5μl，TaqDNA酶0.5μl，无菌三蒸水27.5μl，模板10μl。?

    4.4.3反应条件94℃预变性4min后，按94℃1min，65℃40s及72℃1min40s的循环程序进行35次循环，最后一个循环结束后再延伸10min。?

    4.4.4琼脂糖电泳取PCR扩增反应产物8μl和5μlDL2000Marker，分别和1～2μl上样缓冲液混匀后，加到含EB的0.8%琼脂糖胶中，在80伏电压下电泳20min，然后在紫外线灯下观察。预期扩增的靶基因为APP外膜脂蛋白基因中610bp大小的片段。?

    5伪狂犬病病原的鉴定(PCR反应)?

    5.1模板制备将6头濒死猪脑、肝等组织混合取样，用1∶5生理盐水匀浆，取1ml到一无菌的EP管中，-20℃反复冻融3次，加0.1mg/ml蛋白酶K和0.5%SDS50℃作用3h或37℃过夜。酚∶仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提两次，用0.6倍体积的异丙醇沉淀，再用75%乙醇洗涤，抽干后，溶于50μl无菌水中，4℃保存备用。

    ?5.2反应体系(25μl)10倍缓冲液2.5μl，25mmol/LMgCl?22.5μl，dNTPs2.0μl，上游引物2.0μl，下游引物2.0μl，TaqDNA酶0.5μl，模板2.0μl，灭菌蒸馏水11.5μl。

    ?5.3反应条件94℃预变性4min后，按94℃1min，65℃40s及72℃90s的循环程序进行30次循环，最后一个循环结束后再延伸10min。?

    5.4扩增产物的观察4.4.4，预期扩增的靶基因为PRVgD基因中217bp大小的片段。

    5.5结果?

    5.5.1胸膜肺炎放线杆菌检测结果见图1。?

    待检样品中胸膜肺炎放线杆菌PCR检测结果（略）

    从中可以发现：在6个待检样品中有2个扩出610bp特异性条带，说明该患猪已经感染猪传染性胸膜肺炎放线杆菌。

    待检样品中伪狂犬病病毒的检测结果（略）?

    从中可以发现：在6个待检样品中有3个扩出217bp特异性条带，说明该患猪已经感染伪狂犬病病毒。?

    6防制?

    6.1猪传染性胸膜肺炎是近几年来出现的新呼吸道疾病，临床上主要以呼吸困难、肺和胸壁粘连为特征；而伪狂犬病可引起繁殖障碍，表现为死胎，流产和产弱仔。本文通过病原学检测最终确诊了这两种疾病呈混合感染。在被检的6头仔猪中，伪狂犬病呈阳性的有3头，而传染性胸膜肺炎呈阳性仅2头，两种同时呈阳性的有2头，从流行病学特征来分析。本次疾病的流行除了引起仔猪的大量死亡外，母猪的繁殖障碍尤其突出，因此，可以认为本次疾病的流行是以伪狂犬病为主，伴发猪传染性胸膜肺炎。

    ?6.2针对APP血清型较多的特点，在本次暴发疾病的控制中，我们采用从送检病料中分离的病原菌扩大培养增殖后，制成灭活苗紧急接种，母猪用氟哌酸，每吨饲料150g拌料给药。同时对母猪群采用本实验室生产的伪狂犬基因缺失灭活苗免疫，并使用伪狂犬病gG基因缺失活疫苗滴鼻免疫。采取上述措施后一周，疫情得到完全控制。